SP3——一种高灵敏的蛋白质组学样品制备方法

蛋白质组学以蛋白质组为研究对象,重点在于研究细胞、组织或生物体蛋白质的组成和功能。由于蛋白质是基因组和转录组变异的最终效应分子,因此它们具有全面性和靶向性。

在人类基因组中有~20000个蛋白编码基因,产生>100000种不同拼接的mRNA,由于大量不同的翻译后修饰,所产生的蛋白质组包含大量的蛋白质。蛋白质组学分析的一个关键步骤是蛋白质的最佳提取和加工,以确保下游检测的最高灵敏度。

目前,蛋白质组样品的最佳处理方法建立在以下基础上:

  • 无差别蛋白的富集和回收
  • 与各种化学试剂(如去垢剂、离液剂和盐)的相容性
  • 大范围进样(ng至mg)内进行定量回收
  • 设备及流程简单
  • 速度快、高通量
  • 低成本

2014年Hughes等学者建立了一种基于顺磁珠的蛋白提取方法-SP3(single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation),随后的几年时间Hughes等对SP3方法进行了优化,优化后的方法达到了上述最佳样品处理至关重要的要求。描述优化后SP3方法的文章Single-pot,solid-phase-enhanced sample preparation for proteomicsexperiments于2019年发表在Nature Protocols上。

该方法的原理是:磁珠表面携带的羧基基团在高浓度有机溶剂的驱动下与蛋白结合,磁珠上的蛋白在水溶液中被胰蛋白酶酶解。由于没有有机溶剂,蛋白/肽从磁珠释放到酶解缓冲液中。

为什么说SP3满足我们认为最佳样品处理至关重要的标准呢?

首先,SP3的主要操作流程如图1所示,蛋白质通过亲水相互作用机制与磁珠结合,结合蛋白后的磁珠存在于溶剂化层(蓝色)中,通过洗涤步骤可以去除污染物。蛋白质在水溶液中被胰蛋白酶在磁珠上酶解,酶解后的蛋白可在水溶液条件下洗脱,然后进行下游处理。所有步骤在一个管中即可完成,设备和流程简单,用时短,速度快,不需要定制硬件,成本低。

图1.利用SP3对基于MS的蛋白质组分析之前的蛋白样品进行处理的流程

其次,SP3在不同的输入量范围建立了相容性,SP3已被证明能有效地处理从单人类卵母细胞(相当~100ng的材料)到毫克级别蛋白质(单个样品>100μg)的材料数量。输入的蛋白质和肽在有机溶剂驱动下无差别地结合在携带羧基基团磁珠的亲水表面上,经过SP3方法处理的样品损失少,效率高。图2是未经处理(对照)和经SP3处理的酵母全细胞裂解液的SDS-PAGE分析结果,与未经处理的对照相比,经SP3处理的裂解物没有明显的蛋白损失,并且显示了SP3蛋白可以进行无差别蛋白的富集和回收。

图2. 未处理(对照组)或SP3处理的酵母全细胞裂解液的SDS-PAGE分析

第三,SP3能提供稳定和高效的蛋白质处理样品。文中重复了用SP3作为纯化方法的全蛋白质组分析的实验。一式三份的体外培养细胞系(HEK-293,每个SP3重复中含有50μg蛋白质)裂解物经SP3处理后用TMT标记,反相分离后进行串联质谱分析。从一式三份的样品中发现,在整个蛋白质组丰度范围内蛋白质广泛富集(n = 9,260个独特蛋白质)。重要的是,在单个复制SP3的富集过程中,回收肽的相关性很高(mean r2 = 0.99, n = 3),变异系数为8.4(n = 87247),显示了该方法具有较好的重复性和稳定性。

图3. SP3处理的蛋白样品与混合物深度定量分析的结果相符合

鉴于以上优点,SP3可运用于大量的蛋白质组学实验,从高灵敏度筛选单人类卵母细胞、果蝇胚胎、免疫细胞、肾元和临床肿瘤组织,到深入分析细胞系、染色质的protein-DNA互作、细胞外基质混合物等。此外,SP3若与自动机械化及微流控技术结合,则能够以高通量方式更快速有效地完成常见的蛋白质组学工作流程。

参考文献:

1. Hughes, C. S. et al.Ultrasensitive proteome analysis using paramag-netic bead technology. Mol. Syst.Biol. 10,757 (2014).

2. Hughes,C. S. et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample prepar-ation for proteomicsexperiments. Nat Protoc. 2019 Jan;14(1):68-85

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