miRNA直接测序研究进展

MicroRNA是一类短的非编码RNAs,在生物体内的主要功能包括RNA沉默和转录后的基因表达调控。由于miRNA的丰度较低、序列相似性高和序列较短等原因,miRNA的直接测序和分析难以展开。近日,南京大学化学化工学院黄硕教授团队利用纳米孔错位测序技术(Nanopore-induced phase-shift sequencing, NIPSS),首次实现了miRNA的直接测序,该成果发表在iScience期刊上。

NIPSS技术是纳米孔测序技术的一种,利用短的核酸序列的直接穿孔过程中所产生的电流差异,从而读取被测物质的序列信息。2012年,Kevin Karplus & Mark Akeson和MichaelNiederweis & Jens H. Gundlach团队分别用该体系进行了DNA序列的读取。黄硕教授团队正是基于以上的纳米孔体系和特殊的模板设计,从而实现了对不同miRNA分子、以及不同表观修饰的miRNA序列的读取和识别。

miRNA测序过程如图1所示。首先,将待测的miRNA片段连接一段DNA,形成一条嵌合体模板。嵌合体模板与引物片段和Blocker DNA退火后生成测序文库(图1A)。Phi29 DNA聚合酶结合测序样本后,在电流驱动下锚定到MspA蛋白孔顺势面,miRNA段穿过纳米孔(图1B)。Blocker DNA从模板解离后,Phi29 DNA聚合酶便以嵌合体序列为模板,驱动DNA的合成。结果如图C和D所示,聚合反应分成DNA和miRNA两段,DNA片段合成后,Phi29 DNA聚合酶以RNA序列为模板,合成互补的cDNA链。伴随着这一合成过程,嵌合体序列反向穿过纳米孔,产生序列的电流信号,通过信号解析(D),从而获取嵌合体模板的序列信息。

为了检测该项技术的准确性和精密程度,作者分别对不同的miRNA分子进行了测序,结果如图2所示。图2A 和2B中,嵌合体模板分别包含miRNA-21和Let-7a 序列。图2C是对两种测序结果的比较。由图可知,两种miRNA序列穿孔时,产生了截然不同的两种电流信号。图C将两种电流信号进行比较发现,序列相同的DNA部分,电流信号强度完全一致,而miRNA部分的电流信号值因RNA序列不同,而呈现完全不同的分布,证明NIPSS技术可以识别两条序列不同的miRNA分子。随后,作者还证实了该技术能够区分携带单个N6-甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine,m6A)的miRNA和不含修饰的miRNA分子。

在基因组、转录组等测序技术普遍开展的今天,该论文首次完成了miRNA的直接测序。在单分子水平上识别miRNA这一技术,能够极大地推动miRNA的发现和研究工作。该项技术的改良和优化,将有助于mi-RNA相关的早期疾病诊断或者启发新的癌症治疗方法。

参考文献

1 Cherf GM, Lieberman KR, Rashid H, Lam CE, Karplus K, Akeson M. Automatedforward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at 5-Å precision. NatBiotechnol. 2012;30(4):344-348. Published 2012 Feb 14. doi:10.1038/nbt.2147

2 Manrao EA, Derrington IM, Laszlo AH, et al. Reading DNA atsingle-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNApolymerase. Nat Biotechnol. 2012;30(4):349-353. Published 2012 Mar 25.doi:10.1038/nbt.2171

3 Zhang J, Yan S, Chang L, et al. Direct microRNA Sequencing UsingNanopore-Induced Phase-Shift Sequencing. iScience. 2020;23(3):100916.

doi:10.1016/j.isci.2020.100916

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