DNA测序技术发展趋势

DNA测序技术自七十年代发展至今已有四十多年的时间,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长, 测序技术已取得了相当大的成就。虽然目前看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有绝对的优势地位,但第三和第四代测序技术也已在最近几年时间内快速发展。DNA测序技术的每一次变革都对基因组研究、疾病医疗研究、药物研发、育种等领域产生巨大的推动作用。

第一代测序技术

1977年桑格(Sanger)和吉尔伯特(Gilbert)分别提出双脱氧链终止法和化学降解法,标志着第一代测序技术的诞生。也正是由于对核酸测序技术做出的重大贡献,Sanger和Gilbert以及发现DNA重组技术的Berg分享了1980年的诺贝尔化学奖。历时13年耗资近3亿美元完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为测序基础的。

第二代测序技术

第一代测序技术的优势在于测序读长可达1000bp,准确性高达99.999%,但因测序成本高、时间久和通量低等缺点,严重影响了其真正大规模的应用。因而以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa,Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标志的第二代测序技术遂应运而生。第二代测序技术除了大大降低测序成本以外,还大幅提高了测序速度,并且保持了高准确性。第一代测序技术完成一个人类基因组的测序需要3年时间,而使用二代测序技术则仅仅需要1周时间。 

测序成本趋势图

第三代测序技术

最近几年测序技术又有新的里程碑,与前两代相比,他们最大的特点就是单分子测序以及长度长,测序过程无需进行PCR扩增,以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术为主,被称之为第三代测序技术。

PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的概念,并以SMRT芯片为测序载体;其基本原理是:DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基, 在碱基配对阶段, 不同碱基的加入会发出不同光, 根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。PacBio SMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来, 他们利用的是ZMW(零模波导孔)原理。SMRT技术的测序速度很快,每秒约10个dNTP。但是,同时其测序错误率比较高(这几乎是目前单分子测序技术的通病),达到15%, 但好在它的出错是随机的,并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向,因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。

Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同,它是基于电信号而不是光信号的测序技术。他们设计了一种特殊的纳米孔,孔内与分子接头共价结合。当DNA碱基通过纳米孔时,它们使电荷发生变化,从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的),通过灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。

纳米孔测序的主要特点是:读长很长,大约在几十kb,甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%,且是随机错误,而不是聚集在读取的两端; 数据可实时读取, 通量很高; 起始DNA在测序过程中不被破坏, 以及样品制备简单又便宜。理论上,它也能直接进行RNA测序。

纳米孔测序

第四代测序技术 目前还有一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术——Ion Torrent。该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片,一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时,会释放出一个氢离子,反应池中的PH发生改变,位于池下的离子感受器感受到H+离子信号,H+离子信号再直接转化为数字信号,从而读出DNA序列。这一技术的发明人同时也是454测序技术的发明人之一的Jonathan Rothberg。Ion Torrent相比于其他测序技术来说,不需要昂贵的物理成像等设备,因此,成本相对来说会低,体积也会比较小,同时操作也要更为简单,速度也相当快速。

Ion Torrent

除了Ion Torrent以外, 安序源生物科技(AXBIO)的四代测序技术也是以半导体芯片为载体, 但与牛津纳米孔或其他公司相比区别较大。除了保持纳米孔测序长读长的优势外还引入了酶促反应,用于生成可辨识度高的单碱基信号。相比传统纳米孔测序直接读取待测核酸序列,这个技术路线具有几个重大优势:第一, 所采集的信号来源大大简化,是真正意义上的单碱基识别,提高了检测信噪比;第二,搭配不同的样品制备方法可以实现对同一个待测 DNA 模板的多次测序,开启可控的高精度测量模式;第三,测量对象与 DNA 序列分离,突破传统直流电压驱动的限制,可以设计更灵敏更快速的极微小驱动及检测单元来提高精度和扩大通量。

测序仪的不断更迭也是市场升级的过程,从研发向临床的一个方向。在这个过程中,需要同时实现低成本、快速、小型化、长读长、无结构性误差。目前第四代测序技术在小型化、速度和读长方面的表现已经很不错了,但是主要问题还是成本较高、准确率不够。

安序源通过提高同时检测 DNA 的通道数,和使用比较通用的、大规模量产的 CMOS 工艺生产的芯片来降低成本;另外在精度方面,还借鉴了以前做得很成功的生物化学流程。安序源的四代测序仪在纳米孔的基础上,结合了生物材料,包括生物酶等,以此来提高测序仪的容错率。

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