Axbio修饰引物介绍

Axbio可提供分子生物学常规引物、修饰引物、DNA Oligo定制合成产品;基因测序研发所需的单核苷酸修饰产品及特有官能团修饰类核酸产品。可根据客户需要,订制合成带有特殊标记的引物,也可按照客户要求合成一系列带有特殊官能团的oligo分子。

1.储存条件

冻干引物和稀释成储液的引物建议储存在-20°C. 在4度能够稳定几个月。储液在-20°C能够稳定至少六个月,在4度能够稳定几个星期。
AP偶联引物- 放在AP储存液中运输,储存在4度,能够稳定12个月。HRP偶联引物-放在HRP储存液中运输,储存在4度,能够稳定12个月。HEX,、TET和FAM对光敏感。应储存在黑暗处或用琥珀色管子储存。推荐放入黑色盒子中。

染料              暴露在光下半衰期(大约)

HEX              4.5 hours

TET              2.25 hours

FAM             1.125 hours

2.稀释方法

对于非Cy类的荧光标记引物,建议用TE稀释,浓度高于10uM。Cy3和Cy5标记的引物在碱性条件下易降解,用中性溶液溶解。

3. 不同类型标记

(1)5’ HEX, TET or 6-FAM 

FAM, HEX and TET是在合成循环结束时以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学作用添加上的,因此是添加到引物的5’末端的糖上而非引物的末端碱基。它们通过磷酸二酯键共价连接到5’端最末的糖环上。在液体中的颜色:HEX是粉红色,FAM是黄色,TET是橙色,经过这些修饰的寡核苷酸不能进行硫代磷酸化修饰。

(2)磷酸化

5’磷酸化作用是通过B-氰乙基化学反应添加到引物5’端的糖环上,而不是最后一个碱基上。3’磷酸盐被连接到固体支持介质上,所以在合成的第一个循环,碱基就与它偶联。它能够阻止聚合酶的延伸。稳定性:假设是DNA:3′-PO4比3′-BIO稳定。3′-BIO在碱性环境下会脱落,而3′-PO4不会。用胶纯化磷酸化引物时,不能区分全长引物和n-1引物,因为磷酸基团带阴性电荷,会影响电泳。有些经HPLC纯化后的磷酸化寡核苷酸在真空离心蒸发浓缩后有些“脏”,或微黄。这可能是因为该产物为综合产物。在做QC时,通过乙醇沉淀可以去除。

(3)硫取代磷酸化

S-oligos 是寡核苷酸中的单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的。这种修饰是在连接的时候进行的(不是在合成后进行的)。碱基被添加上后,再进行连接修饰。在两个碱基之间的磷酸可以转换成双键“S”(用Beaucage试剂)代替普通的双键“O”(用碘溶液)。最终合成的寡核苷酸不是立体结构单一的形式,它们是R和S立体异构体的混合物。    和磷酸二酯键相连的碱基都可以进行这种修饰。因为从固体支持物上解离下来时,3‘末端碱基是OH,不能进行硫代磷酸化。我们可以提供对S-oligo进行5‘修饰,如客户可以定制S-oligo的荧光素标记。我们不能提供在保存其它碱基“正常”的情况下使某些位置的碱基硫代磷酸化。这是由于法定原因而不是化学合成的问题。

   
S-oligo和普通的寡核苷酸在胶上的位置是一样的。用HPLC纯化方法纯化硫代磷酸化修饰的寡核苷酸时,带形双峰或者带形很宽。推荐的纯化方式:脱盐或HPLC或多重HPLC (反相和阴离子交换HPLC)。很多参考资料用HPLC纯化引物用于反义引物的研究。有一个参考文献比较了HPLC和脱盐纯化的寡核苷酸,发现没有区别Phospothioate的特性:化学稳定、在水溶液中稳定、能够抵抗核酸酶;应用:磷酸硫代的反义引物在体内通过很多不同的机制起作用。它们可以通过RNA水平抑制逆转录活性(抑制RNA病毒复制)。形成激活RNase H活性的底物[S-ODNs和RNA形成双链,使RNA更容易被RNase H切断]。反义寡核苷酸还能够直接干扰转录或抑制翻译。    


存在于胞内和血液/培养基中的核酸酶对S-Oligos的影响不大。因为S-ODNs保持了寡核苷酸的带电状态,它们能够通过和阳离子脂类形成复合体而进入细胞。它们也存在转染率低的问题。反义引物在mRNA中的作用位点不同时,反义引物起的作用也不同(如寡核苷酸和mRNA上的转录起始密码子互补,敲降效果就很好)。  

文中未提及的常规引物有:BHQ1 、 BHQ2 、 CY3、 CY5 、 FITC 、 JOE 、 TAMRA 、 FAM dT 、 ROX;AMCA、 BODIPY®、 DABCYL 、 5’DABCYL 、 Digoxin 、 Digoxin dT 、 5’-Spacer 18 、 3’-Eclipse 、 Deoxyinosine 、 Deoxyuracil 、 Me-dC。
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