纳米孔结合DNA折纸术应用于生物单分子检测

快速低成本的生物标志物检测在现代疾病早期诊断变得越来越重要。由于在疾病早期阶段相关的生物标志物通常以非常低的浓度存在,这为检测技术带来了相当大的挑战。

通常单个分子与生物标志物的相互作用对积累测定结果贡献非常微小的信号。在最近研究的单分子检测方法中,纳米孔传感器通过检测电流随时间变化来检测单个蛋白显得颇有应用前景。在纳米孔器件中,单个分子易位使纳米孔中原本稳定的离子流产生瞬时调制,通过该电流变化能够检测通孔分子。这种方法已在许多蛋白质和DNA检测的研究中采用。

从复杂的混合物中检测特定分子非常困难,因为当纳米孔的直径远大于分子的大小时,单个蛋白分子的易位速度通常很高。单分子易位只会产生微弱的电流信号,并相应地降低了信噪比。此外,由不同蛋白质产生的信号通常非常相似且难以区分。

为了解决这些问题,可以利用DNA作为蛋白分子载体,并减少易位速度。线性DNA分子通过折叠形成稳定几何结构来形成载体分子,通过结构设计能够容纳各种分子。这些稳定的DNA纳米结构,称为DNA折纸。这为容纳各种分子提供了一种通用的载体平台。重要的是,可以使用纳米孔检测单个DNA折纸,并且根据其几何形状,其易位产生不同的离子电流信号。

二维DNA同心正方形折纸结构通过纳米孔易位时的离子电流指纹取决于其几何形状。当折纸中心存在空腔会导致离子电流中的峰分裂为双峰。如果将DNA折纸设计成在中央包含一个腔,分析物特异性地结合到该腔中,则可以通过纳米孔观察特征性易位信号来检测折纸中分析物的存在与否。同时通过观察大量单个峰来计算两个特征不同的峰的频率,从而获得分析物浓度的信息(图1)。

人C反应蛋白(CRP)是一种确定的炎症标记物。该蛋白以五聚体的形式存在,分子量约为125kDa,尺寸约为11nm。通过设计DNA纳米结构,其中央腔体足够大,可以容纳CRP分子。这样,腔体中CRP的存在将对易位离子电流产生可测量的差异。将内部锚定柄引入中央腔体中,以便通过DNA杂交将特定的捕获部分置于腔体内部(DNA适配体),使得该DNA空腔结构能够特异的捕获CRP。

为了在单分子纳米孔传感中利用DNA纳米结构载体,被占用和未被占用的DNA载体需要具有唯一的指纹(由驻留时间,离子电流峰的幅度和形状组成),这些指纹与载体中CRP的存在有关。对100多个未被占用的DNA载体易位峰的定量分析显示,未占用载体通过纳米孔时电流峰幅度为65±6pA,在纳米孔内停留时间为0.29±0.1ms。将CRP和DNA载体孵育后的溶液进行纳米孔易位测试,结果显示离子流中出现单峰和双峰的混合。对两类峰的峰幅度和停留时间的分析显示出双极性分布。双峰的平均峰振幅为62±4pA,停留时间为0.33±0.03ms。相比之下,对50多个单峰的分析显示,平均停留时间和峰幅度分别为0.15±0.05 ms和90±9 pA,这表明由于CRP结合,DNA载体在纳米孔通孔易位时的峰值电流和停留时间均发生了显著变化,被占用和未被占用的DNA载体能够明显的区分。表明DNA适配体功能化的DNA折纸可以捕获特异性分析物,并且被占用和未被占用的DNA折纸的易位指纹信号很容易区分。除了特征上不同的峰形外,峰幅度和驻留时间还可以用来区分被占用和未被占用的DNA载体(图2)。

这些DNA纳米结构中离子电流峰特征与腔体几何结构之间的关系为检测小分子的存在提供了机会。这种载体/纳米孔生物传感方法是基于对单个生物标志物进行计数,而不是依赖于整体平均信号。这为检测低浓度的生物标记物提供了可行的检测方法。

参考文献

Raveendran, M., Lee, A.J., Sharma, R. et al. Rational design of DNA nanostructures for single molecule biosensing. Nat Commun 11, 4384 (2020).

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