生物纳米孔也可以“私人定制”?

纳米级尺寸的人工或生物孔用于生物分子,如DNA,RNA,肽,蛋白质和多糖的检测具有巨大的应用前景。


生物纳米孔具有稳定的分子结构可控的物理化学性质以及能够重复大量制备等优点被广泛用于分子检测领域的研究,但自然界中发现的生物纳米孔孔径固定,这在很大程度上限制了生物纳米孔的应用,例如野生型的α-溶血素(α-hemolysin)其七聚体形成的纳米孔有固定孔径,感知区域最窄约1.3nm,用于核酸易位检测时只能通过单链分子。

生物纳米孔由蛋白分子组成,因此可以通过化学修饰或基因工程进行精确操纵,调节其孔径和物理化学性质。最近研究人员系统地研究了一组突变气单胞菌溶素(aerolysin)纳米孔


通过定点诱变可以将该纳米孔的感应区域直径精确控制在5到15Å之间,从而大大扩展了溶血素纳米孔的检测能力范围。可以通过在双β桶帽结构域和孔出口区域替换不同带电氨基酸来调节离子的选择性,从而提高对特定生物分子(如ssDNA,带负电和带正电的多肽)检测的选择性。

气溶素(aerolysin)由嗜水气单胞细菌产生,是β成孔毒素(β-pore formation toxin)。通常气溶素单体以非活性形式分泌,当它的C端肽被蛋白酶水解切割后激活,并由GPI锚定蛋白结合到宿主膜上,气溶素单体再组装为一个七聚体形成纳米孔。

通过定点突变改造纳米孔内四个感应区域(R282,R220,K238和K242)的氨基酸来调节其性质:以丙氨酸替代扩大孔径(即R282A,R220A,K238A和K242A);以色氨酸替代减小孔径(R282W,R220W,K238W和K242W);为研究静电的影响,将带正电的氨基酸R220替换为另一个不同电性的的正(R220K),负(R220E)或中性(R220Q)氨基酸,在纳米孔出口感应区域K238进行和R220类似的不同带电氨基酸突变(K238R, K238N, K238E和K238Q)。

将这一系列突变体纳米孔用于单链核酸(dA4)易位通孔实验发现,与野生型相比,R282A的孔没有信号,R220A和R220W的易位事件很少,这表明位于帽区域的带正电荷的氨基酸对于捕获带负电荷的分子至关重要,对于K238位置的突变,除K238Q外,核酸易位事件的频率变化不大,但dA4的驻留时间在所有该位点的突变体中均受到很大影响。

将易位分子替换为带负电荷的多肽(EYQ3),序列为EYQEYQEYQ。在正偏压(100 mV)下,观察到相对于野生型孔,K238A,K238Q和K238N突变体显示出显著延长的孔内驻留时间,和dA4易位类似。EYQ3的驻留时间与R220区域的直径具有很好的相关性,而易位事件的频率除K238Q之外一直保持不变。因此,K238区域的定点突变改造可用于调节气溶素纳米孔对整体带负电荷分子(包括DNA和肽)的传感特性。

将带正电的多肽,HIV-1 Tat蛋白的短片段,序列YGRKKRRQRRR用于易位测试发现,对于野生型孔,几乎没有获得任何信号,表明野生型气溶素纳米孔捕获正电的肽的能力非常差,这可以用孔入口处的正静电势与带正电分子排斥作用来解释。当帽区域中带正电荷的氨基酸被中性氨基酸取代时,它们能够捕获带正电的多肽:R282A,R220A和R220W突变体对带正电的肽表现出优异的捕获能力。

这些结果表明,经改造的气溶素纳米孔可以扩展到检测带有正电荷的分子。具有不同化学特征的分子原则上可以通过对纳米孔进行适当的突变来实现特异性地检测。这种可能性使得开发基于气溶素纳米孔的单分子蛋白质检测方法非常具有前景。

参考文献

(1) Cao, C.;Cirauqui, N.; Marcaida, M. J.; Buglakova, E.; Duperrex, A.; Radenovic, A.; DalPeraro, M. Single-Molecule Sensing of Peptides and Nucleic Acids by EngineeredAerolysin Nanopores. Nature Communication 201910, 4918.

(2) Liao,D. F.; Cao, C.; Ying, Y. L.; Long, Y. T. A General Strategy of AerolysinNanopore Detection for Oligonucleotides with the Secondary Structure. Small 2018,14, e1704520.

(3)Iacovache, I.; De Carlo, S.; Cirauqui, N.; Dal Peraro,M.; van der Goot, F. G.; Zuber, B. Cryo-Em Structure of Aerolysin VariantsReveals a Novel Protein Fold and the Pore-Formation Process. Nature Communication2016, 7, 12062.

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