双纳米孔系统-高效率、高保真的单分子测序方法

纳米孔测序技术是新兴的测序技术,基于生物大分子通过纳米孔的时候引起电流的变化,通过捕获电流变化来识别碱基。纳米孔测序无需进行扩增和标记,可直接读取核酸序列,速度快,成本低。

传统的纳米孔传感的一个问题是只能测量一次通过的分析物的信号,这严重限制了分析物鉴定的保真度。有两种方法可解决这个问题:降低纳米孔移位的速度或通过纳米孔多次捕获同一分子。

双纳米孔系统有可能实现对核酸聚合物序列的多次读取,或者重复测量结合在DNA上的同一蛋白质的阻滞。Adnan Choudhary等学者通过粗粒度和全原子分子动力学模拟描述并演示了一种双纳米孔系统,单链DNA分子(ssDNA)捕获和穿梭的效率为100%,并展示了从同一分子进行多次读取而提高DNA序列识别的保真度。

研究者利用COMSOL软件获得静电势的分布和流体流动曲线,使用ARBD软件包进行双纳米孔系统捕获ssDNA的所有模拟,利用全原子MD方法与空间排阻模型(SEM)组合以模拟ssDNA分子的无限深度测序。模拟的双纳米孔系统由三个充满溶液的空间组成:两个平行的运输通道和一个横流室,该室通过薄膜与运输通道隔开,如图1所示。每个运输通道通过位于最窄部分的纳米孔与流动室相连。将DNA置于第一个输送通道的矩形部分,图1a。然后在溶液填充空间的入口和出口处的压力和电压差的引导下,DNA以100%的效率穿过第一个纳米孔,然后穿过第二个纳米孔。

图1. ssDNA 穿过双纳米孔系统的MD模拟

研究者利用1 kbp ssDNA的不同初始构象开始重复进行100次模拟来表征纳米孔捕获和穿梭的保真度,模拟条件是偏压最大为1 V(双纳米孔捕获实验中使用的典型值为600 mV)压差范围为0.01至1个atm。在第一次捕获时,流体在纳米孔所在的通道收缩处的流速要比入口/出口表面的流速高(图2a、b所示)。图2c提供了在第一个输送通道中的流动曲线的更详细视图,以及在典型的ssDNA捕获模拟过程中实现的ssDNA构象的三个代表性形态。虽然每个模拟从开始到纳米孔捕获所花费的时间分布广泛(图2d),但在所有的100个模拟中都观察到了DNA捕获,这意味着模拟是跨通道系统以100%的效率捕获ssDNA。从图2e中观察到所有ssDNA捕获事件中约有一半是从捕获位于DNA末端的前一百个核苷酸的DNA片段开始的。

图2. ssDNA 捕获的统计分析

100%ssDNA捕获效率之所以得以实现,部分原因是由于压力差迫使溶剂通过第一个输送通道。虽然降低压力会使DNA到达第一个孔的时间更长,但增加压力可能会产生更严重的后果:这将增加DNA错过进入纳米孔的机会(图3a)。在每个压力值下,可以看到DNA在经过纳米孔之后采用了新的平衡位置,并在较低压力下更靠近纳米孔入口(图3b、c、d)。这可能是一个很小但明显足够的电场从纳米孔泄漏到运输通道,并对DNA施加一个力,抵消溶剂流动的力将其拉回原位(图3f)。

图3. 捕获错过纳米孔入口的分子

流过第一个纳米孔的离子电流的明显阻断是第一个纳米孔捕获DNA的标志,此事件可用于调整实验条件,以增加双纳米孔穿孔的机会。双纳米孔穿梭的最佳条件是当第一个输送通道的电势没有完全关闭而是从-600升高到-100 mV的过程中,施加足以抵消熵回拉的力,但又不要在流动室中产生太大的拉力而产生额外的ssDNA松弛。当电势为-100mv、压强为0.2atm时能保持DNA笔直并紧靠室壁,以最大程度地提高DNA进入第二孔并被捕获的可能性(图4)。

图4. 影响第二个纳米孔捕获的条件

DNA链进入第二个纳米孔后进一步调整触发电势V1和压差,此时第二个纳米孔捕获物分为“末端优先”或“折叠”捕获。对于末端优先捕获,流动室中的核苷酸数量在首次捕获后稳定增加,直到内部大约有330个核苷酸的最大值为止(图5a)。此时,DNA分子的末端被第二个纳米孔捕获,第二个传输通道中的核苷酸数量上升4μs后静电势设置为V1 = V2 = +600 mV,DNA固定在此位置,随后任何一个腔室中的核苷酸数量都不会改变。对于折叠捕获, DNA分子沿其长度折叠到了第一个纳米孔中,并且在第一次捕获后,第一个纳米孔中有两个相同的ssDNA分子片段。在第二次捕获时,该DNA分子再次以折叠构象进入第二个纳米孔(图5b)。在4μs之后,将静电势设置为使DNA分子保持静止,但是由于DNA的一端仍存在于流动室中,当DNA的一半被拉过第二个纳米孔,第二个孔道和流动室中作为自由端的核苷酸数量显著变化了。为了了解不同捕获模式的频率,研究者测定了每个模拟第一次捕获和第二次捕获之间的时间tcap,以及第二次捕获时的流室中核苷酸的数量Nout,图5c中结果表明一半的概率出现末端优先捕获,而第二个孔则是折叠捕获优先。

图5. 第二个孔捕获的统计分析

最后,为了证明了双纳米孔系统在DNA测序中的潜在实用性,研究者选择两个相同的直径为1.5 nm的六方氮化硼(hBN)纳米孔的系统模拟了实验情况。相同的DNA片段被两个纳米孔捕获,通过在每个模拟系统上交替施加偏压来实现通过双纳米孔系统DNA的来回移位,当链的末端到达模拟系统的边缘时,反转移位方向。在将DNA来回移动数十次后,识别保真度提高到90%以上。

综上,这种双纳米孔系统具有显著提高DNA和RNA测序保真度的潜力。这种方法可用作对单个DNA和RNA分子进行高通量,直接和超长读取。不过,要实现这种无限深度测序,必须克服一些技术难题。例如设备制造,除了雕刻输送通道和读取器纳米孔外,还需要结合表面涂层以防止DNA粘附到设备表面。

© Copyright 2019 安序源生物科技(深圳)有限公司 All Rights Reserved.