不同荧光素标记oligo单体的应用

随着现代生物医药迅速发展,寡核苷酸标记技术在其各个领域发挥着重要的作用。修饰寡核苷酸可以开发诊断测试、治疗方法、检测方法、遗传分析,同时还可应用于基因合成、生物传感器、化妆品和农业,但其最主要应用领域是诊断和治疗。

诊断领域是寡核苷酸市场中增长最快的领域。这主要是由于检测方法的进步所驱动,尤其是在qPCR和测序技术方面。这些测序技术改进需要结合检测标记的改进,例如荧光团或电化学标记,以微调这些技术以提供更高的灵敏度和选择性。

以荧光素标记为例:在使用荧光素型染料标记寡核苷酸中,标签的选择是多种多样的,同时也取决于芳环的氯化程度。这决定了染料的荧光发射。5′-荧光素-CE亚磷酰胺(6-FAM)(化合物1),衍生自单一异构体6-羧基荧光素,5′-六氯荧光素-CE亚磷酰胺(化合物2)和5′-四氯荧光素-CE亚磷酰胺(TET (化合物3))可全部用于在5’端标记寡核苷酸。

化合物1
化合物2
化合物3


另外两种可用于用荧光素标记寡核苷酸亚磷酰胺。虽然6-荧光素-CE亚磷酰胺(化合物4)和荧光素-CE亚磷酰胺(化合物5)都掺入了与化合物1相同的荧光染料,但连接主链却有所不同。

化合物4
化合物5
化合物6

化合物4具有1,3-二醇结构,其中另外一个的OH被DMTr保护。这不仅可以通过DMTr释放来监测耦合效率,还可以用于Oligo链状寡核苷酸分子的合成单元,例如,DNA探针技术。但是,这通常需要在每次添加之间结合连接子,以防止荧光素的自行猝灭。以相同的方式使用C3间隔(化合物6)来模拟dR的3’端和5’端之间的距离,化合物4的1,3-二醇排列显示了相同的情况。必须指出的是,与间隔基-C3一样,主链会发生扭曲,尤其是多次引入时。与所有5′-DMTr保护(或相似的)一样,DMTr基团可辅助用于纯化。

荧光素-CE亚磷酰胺(化合物5)具有与化合物4相同的功能性,但在这种情况下,连接点通过硫脲键连接到荧光素上。这模仿了将荧光素掺入氨基修饰的寡核苷酸的原始方法。必须注意,在这种情况下,连接方式通过5‘端连接形成一个完整的系统。

下图中3’末端荧光素也可以作为oligo引物合成的单体。使用荧光标记引物,通常选荧光素在5′端-异构体或3′-荧光素CPG(化合物7)和由6-FAM制备的3′-(6-荧光素)CPG(化合物8)。此外,我们还可以用3′-(6-FAM)CPG(化合物9)和Fluorescein-dT CPG(化合物10),它们也衍生自6-羧基荧光素。化合物8还可以有效阻止聚合酶延伸以及核酸外切酶3’活性末端,化合物9在这两种过程中起到促进作用。当使用这些载体中的任何一种时,通常用氢氧化铵进行的切割和脱保护,释放出荧光素标记的寡核苷酸。

化合物7
化合物8
化合物9
化合物10

参考文献:Fluorescence based strategies for genetic analysis, R.T. Ranasinghe and T. Brown, Chem. Commun. , 54875502, 2005.

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